米粉之家
Rice noodle
 
解密米粉
GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一)
2015-10-16

本标准代替GB4789.4—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、SN0170—1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法 5部分:沙门氏菌检验》。
整合后的标准与GB4789.4—2010相比,主要变化如下:
———
修改了检测流程和血清学检测操作程序;
———
修改了附录A 和附录B
1
范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1
冰箱:2~5
2.2
恒温培养箱:36±1,42±1
2.3
均质器。
2.4
振荡器。
2.5
电子天平:感量0.1g
2.6
无菌锥形瓶:容量500mL,250mL
2.7
无菌吸管:1mL(0.01mL刻度)10mL(0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.8
无菌培养皿:直径60mm,90mm
2.9
无菌试管:3mm×50mm10mm×75mm
2.10 pH
计或pH 比色管或精密pH 试纸。
2.11
全自动微生物生化鉴定系统。
2.12
无菌毛细管。
3
培养基和试剂
3.1
缓冲蛋白胨水(BPW):A.1
3.2
四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:A.2
3.3
亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:A.3
3.4
亚硫酸铋(BS)琼脂:A.4
3.5 HE
琼脂:A.5
3.6
木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:A.6
3.7
沙门氏菌属显色培养基。
3.8
三糖铁(TSI)琼脂:A.7
3.9
蛋白胨水、靛基质试剂:A.8
3.10
尿素琼脂(pH7.2):A.9
3.11
氰化钾(KCN)培养基:A.10
3.12
赖氨酸脱羧酶试验培养基:A.11
3.13
糖发酵管:A.12
3.14
邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:A.13
3.15
半固体琼脂:A.14
3.16
丙二酸钠培养基:A.15
3.17
沙门氏菌OH Vi诊断血清。
3.18
生化鉴定试剂盒。
4
检验程序

沙门氏菌检验程序见图1

GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一)

5 操作步骤
5.1
预增菌
无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW 的无菌均质杯或合适容器内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,1mol/mL 无菌NaOH HClpH 6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,36±1培养8h~18h。如为冷冻产品,应在45以下不超过15min,2~5不超过18h解冻。
5.2
增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB,42±1培养18h~24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC,36±1培养18h~24h
5.3
分离
分别用直径3mm的接种环取增菌液1,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),36±1分别培养40h~48h(BS琼脂平板)18h~24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1

GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一)

5.4 生化试验
5.4.1
自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,36 ±1 培养18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2

GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一) 

5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36±1培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2~5或室温至少保留24h,以备必要时复查。
GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一)

5.4.2.1 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一)

5.4.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3
反应序号A3:补做ONPGONPG 阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4
必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一)

5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5
血清学鉴定
5.5.1
检查培养物有无自凝性
一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻摇动30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自凝性,反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。
5.5.2
多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm 的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O 血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(
2%~3%)
培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O 凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
5.5.3
多价鞭毛抗原(H)鉴定
操作同5.5.2H 抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,待菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1~2,自远端取菌培养后再检查。
5.6
血清学分型(选做项目)
5.6.1 O
抗原的鉴定
A~F多价O 血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株,不能分型。
A~F多价O 血清凝集者,依次用O4;O3O10;O7;O8;O9;O2O11因子血清做凝集试验。
根据试验结果,判定O 群。被O3O10血清凝集的菌株,再用O10O15O34O19单因子血清做凝集试验,判定E1E4各亚群,每一个O 抗原成分的最后确定均应根据O 单因子血清的检查结果,没有O单因子血清的要用两个O 复合因子血清进行核对。
不被A~F多价O 血清凝集者,先用9种多价O 血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O 群血清逐一检查,以确定O 群。每种多价O 血清所包括的O 因子如下:
O
多价1 A,B,C,D,E,F(并包括6,14)
O
多价2 13,16,17,18,21
O
多价3 28,30,35,38,39
O
多价4 40,41,42,43
O
多价5 44,45,47,48
O
多价6 50,51,52,53
O
多价7 55,56,57,58
O
多价8 59,60,61,62
O
多价9 63,65,66,67
5.6.2 H
抗原的鉴定
属于A~FO 群的常见菌型,依次用表6所述H 因子血清检查第1相和第2相的H 抗原。

GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一)

不常见的菌型,先用8种多价H 血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血清所包括的各种H 因子血清逐一检查,以第1相和第2项的H 抗原。8种多价H 血清所包括的H 因子如下:
H
多价1 a,b,c,d,i
H
多价2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H
多价3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H
多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H
多价5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H
多价6 z39,z41,z42,z44
H
多价7 z52,z53,z54,z55
H
多价8 z56,z57,z60,z61,z62
每一个H 抗原成分的最后确定均应根据H 单因子血清的检查结果,没有H 单因子血清的要用两个H 复合因子血清进行核对。
检出第1H 抗原而未检出第2H 抗原的或检出第2H 抗原而未检出第1H 抗原的,可在琼脂斜面上移种1~2代后再检查。如仍只检出一个相的H 抗原,要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下:
简易平板法:0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
小玻管法:将半固体管(每管约1mL~2mL)在酒精灯上溶化并冷至50,取已知相的H 因子血清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内,待凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。
培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1200~1800的量加入。
小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50,挑取因子血清1,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,待凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,36培养后再做凝集试验。
5.6.3 Vi
抗原的鉴定
Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。
5.6.4
菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果,按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6
结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。

A
培养基和试剂
A.1
缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1
成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠5.0g
磷酸氢二钠(12个结晶水) 9.0g
磷酸二氢钾1.5g
蒸馏水1000mL
A.1.2
制法
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH 7.2±0.2,高压灭菌121,15min
A.2
四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
A.2.1
基础液
蛋白胨 10.0g
牛肉膏5.0g
氯化钠3.0g
碳酸钙45.0g
蒸馏水1000mL
除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH 7.0±0.2,高压灭菌121,20min
A.2.2
硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠(5个结晶水) 50.0g
蒸馏水加至100mL
高压灭菌121,20min
A.2.3
碘溶液
20.0g
碘化钾25.0g
蒸馏水加至100mL
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。
A.2.4 0.5%
煌绿水溶液
煌绿0.5g
蒸馏水100mL
溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。
A.2.5
牛胆盐溶液
牛胆盐 10.0g
蒸馏水100mL
加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121,20min
A.2.6
制法
基础液 900mL
硫代硫酸钠溶液100mL
碘溶液20.0mL
煌绿水溶液2.0mL
牛胆盐溶液50.0mL
临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种成分。

A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨 5.0g
乳糖4.0g
磷酸氢二钠10.0g
亚硒酸氢钠4.0g
L-胱氨酸0.01g
蒸馏水1000mL
A.3.2 制法


除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55℃以下,以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液15mL,使溶解,再加无菌蒸馏水至100mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH 至7.0±0.2。


A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏5.0g
葡萄糖5.0g
硫酸亚铁0.3g
磷酸氢二钠4.0g
煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL
柠檬酸铋铵2.0g
亚硫酸钠6.0g
琼脂18.0g~20.0g
蒸馏水1000mL
A.4.2 制法


20mL和30mL蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中,琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至80℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。
将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH 至7.5±0.2,随即倾入琼脂液中,混合均匀,冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。


GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(二)


米粉文化

对于湖南人,米粉是必不可少的早餐,是湖南人居家旅行必备良品,早上起来饿了,去嗦碗粉;上班累了困了,去嗦碗 粉;米粉在湖南人心中扎了根。传统米粉的生产,是手工操作的作坊式,把浸泡好的大米 了解更多 >

栏目导航
> 首页
> 米粉起源
> 行业资讯
> 政策法规
> 吃好米粉
> 产品陈列
> 走进克明
> 订货平台
联系我们

联系电话:0731-86788901 0731-86788902
电子邮箱:CKMMF2016@163.com
公司地址:湖南省长沙市雨花区