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GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(二)
2015-10-16

GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(一)


将前三种成分加入300mL蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中,琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至80℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。
将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH 至7.5±0.2,随即倾入琼脂液中,混合均匀,冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48h会降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.5 HE 琼脂(HektoenEntericAgar)
A.5.1 成分
蛋白胨 12.0g
牛肉膏3.0g
乳糖12.0g
蔗糖12.0g
水杨素2.0g
胆盐20.0g
氯化钠5.0g
琼脂18.0g~20.0g
蒸馏水1000mL
0.4%溴麝香草酚蓝溶液16.0mL
Andrade指示剂20.0mL
甲液20.0mL
乙液20.0mL
A.5.2 制法
将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH 至7.5±0.2。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠 34.0g
柠檬酸铁铵4.0g
蒸馏水100mL
③乙液的配制
去氧胆酸钠 10.0g
蒸馏水100mL
④Andrade 指示剂
酸性复红 0.5g
1mol/L氢氧化钠溶液16.0mL
蒸馏水100mL
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1mL~2mL。
A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
A.6.1 成分
酵母膏 3.0g
L-赖氨酸5.0g
木糖3.75g
乳糖7.5g
蔗糖7.5g
去氧胆酸钠2.5g
柠檬酸铁铵0.8g
硫代硫酸钠6.8g
氯化钠5.0g
琼脂15.0g
酚红0.08g
蒸馏水1000mL
A.6.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.4±0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.7 三糖铁(TSI)琼脂
A.7.1 成分
蛋白胨 20.0g
牛肉膏5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖1.0g
硫酸亚铁铵(含6个结晶水) 0.2g
酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0mL
氯化钠5.0g
硫代硫酸钠0.2g
琼脂12.0g
蒸馏水1000mL
GB4789.4—2016
1 2
A.7.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.4±0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约2mL~4mL,高压灭菌121 ℃10min或115℃15min,灭菌后制成高层斜面,呈桔红色。
A.8 蛋白胨水、靛基质试剂
A.8.1 蛋白胨水
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0g
氯化钠5.0g
蒸馏水1000mL
将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.4±0.2,分装小试管,121℃高压灭菌15min。
A.8.2 靛基质试剂
A.8.2.1 柯凡克试剂:将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。
A.8.2.2 欧-波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95% 乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。
A.8.3 试验方法
挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d~2d,必要时可培养4d~5d。加入柯凡克试剂约0.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5mL,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。
A.9 尿素琼脂(pH7.2)
A.9.1 成分
蛋白胨 1.0g
氯化钠5.0g
葡萄糖1.0g
磷酸二氢钾2.0g
0.4%酚红3.0mL
琼脂20.0g
蒸馏水1000mL
20%尿素溶液100mL
A.9.2 制法
除尿素、琼脂和酚红外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.2±0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂后分装,121 ℃高压灭菌15min。冷至50 ℃~55 ℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%。分装于无菌试管内,放成斜面备用。
A.9.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
A.10 氰化钾(KCN)培养基
A.10.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠5.0g
磷酸二氢钾0.225g
磷酸氢二钠5.64g
蒸馏水1000mL
0.5%氰化钾20.0mL
A.10.2 制法
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后121 ℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为1∶10000),分装于无菌试管内,每管约4mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
A.10.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36℃±1℃培养1d~2d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)。
注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。
A.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基
A.11.1 成分
蛋白胨 5.0g
酵母浸膏3.0g
葡萄糖1.0g
蒸馏水1000mL
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0mL
L-赖氨酸或DL-赖氨酸0.5g/100mL或1.0g/100mL
A.11.2 制法
除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5%加入,DL-赖氨酸按1%加入。调节pH 至6.8±0.2。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内,每管0.5mL,上面滴加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。
A.11.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36℃±1 ℃培养18h~24h,观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。
A.12 糖发酵管
A.12.1 成分
牛肉膏 5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠3.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水) 2.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0mL
蒸馏水1000mL
A.12.2 制法
A.12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后,调节pH 至7.4±0.2。按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min。
A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内,以无菌操作分装小试管。
注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
A.12.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36℃±1℃培养,一般2d~3d。迟缓反应需观察14d~30d。
A.13 邻硝基酚β-D 半乳糖苷(ONPG)培养基
A.13.1 成分
邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)
(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)
60.0mg
0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10.0mL
1%蛋白胨水(pH7.5) 30.0mL
A.13.2 制法
将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于无菌的小试管内,每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。
A.13.3 试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36℃±1℃培养1h~3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生,则于1h~3h变黄色,如无此酶则24h不变色。
A.14 半固体琼脂
A.14.1 成分
牛肉膏 0.3g
蛋白胨1.0g
氯化钠0.5g
琼脂0.35g~0.4g
蒸馏水100mL
A.14.2 制法
按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH 至7.4±0.2。分装小试管。121℃高压灭菌15min。直立凝固备用。
注:供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验等用。
A.15 丙二酸钠培养基
A.15.1 成分
酵母浸膏 1.0g
硫酸铵2.0g
磷酸氢二钾0.6g
磷酸二氢钾0.4g
氯化钠2.0g
丙二酸钠3.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0mL
蒸馏水1000mL
A.15.2 制法
除指示剂以外的成分溶解于水,调节pH 至6.8±0.2,再加入指示剂,分装试管,121 ℃高压灭菌15min。
A.15.3 试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种,于36℃±1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。
附 录 B
常见沙门氏菌抗原
常见沙门氏菌抗原见表B.1。


GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检测 沙门氏菌检验(二)


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